摘要

目的：通过观察健骨颗粒氯仿萃取部位对体外培养成骨细胞的影响，研究其调控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号通路影响成骨细胞分化的可能机制。方法：选用年龄<3 d的BALB/c小鼠，从其颅盖骨提取原代成骨细胞，并采用碱性磷酸酶染色法对所提取的细胞进行鉴定；取生长状态良好的第3代成骨细胞作为实验对象，将健骨颗粒氯仿萃取部位稀释至不同的浓度梯度，即设置0、2、4、8、16、32、64 ng/mL 7个药物浓度组对细胞进行干预，采用MTT法筛选健骨颗粒氯仿萃取部位促进成骨细胞增殖的最佳浓度，作为最佳药物干预浓度进行后续实验。取第3代细胞，将其分为空白组、抑制剂组（BMP2抑制剂Noggin干预）、药物组（健骨颗粒氯仿萃取部位干预）和抑制剂加药物组（Noggin加健骨颗粒氯仿萃取部位干预），按组别干预后进行后续实验。采用RT-PCR检测各组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及成骨细胞分化相关基因ALP、CollagenⅠmRNA的表达水平；采用Western blot法检测各组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及ALP、CollagenⅠ的蛋白表达，观察健骨颗粒氯仿萃取部位对成骨细胞分化的影响。结果：经碱性磷酸酶染色法鉴定，所提取的原代细胞阳性率高达90%为成骨细胞；采用MTT法检测发现健骨颗粒氯仿萃取部位在药物浓度为32 ng/mL时，成骨细胞增殖速度最快，在干预2 d时达到增殖高峰，故选用32 ng/mL干预2 d作为健骨颗粒氯仿萃取部位最佳干预浓度进行后续实验；RT-PCR与Western blot检测结果显示，与空白组相比，抑制剂组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及ALP、CollagenⅠ各指标基因表达水平显著降低，蛋白相对表达量明显降低（P<0.01或P<0.05）；与空白组相比较，药物组6个指标基因表达水平显著升高，蛋白相对表达量也明显升高（P<0.01或P<0.05）；抑制剂加药物组与抑制剂组比较，各指标基因表达水平和蛋白相对表达量均显著升高（P<0.01或P<0.05）。结论：(1)使用Noggin抑制细胞内BMP2的表达后，Smad1、Runx2、Osterix的基因和蛋白的表达明显下降，与此同时成骨细胞分化相关指标ALP、CollagenⅠ基因和蛋白表达也明显下降，提示BMP2通路与成骨细胞分化密切相关。(2)健骨颗粒氯仿萃取部位干预原代成骨细胞后能够升高细胞内BMP2、Smad1、Runx2、Osterix与成骨细胞分化相关指标ALP、CollagenⅠ基因和蛋白的表达，促进成骨样细胞分化；提示健骨颗粒氯仿萃取部位可以通过调控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix通路，促进成骨细胞分化，从而达到防治绝经后骨质疏松症的作用。

关键词