摘要

目的 采用网络药理学探讨牡丹皮改善脓毒症血管通透性的作用和机制研究，并进行实验验证。方法 利用TCMSP数据库和文献检索筛选牡丹皮活性成分；使用PharmMapper、SwissTargetPrediction数据库对牡丹皮的活性成分作用靶点进行预测，利用GeneCards和OMIM数据库分别筛选脓毒症与血管通透性的疾病靶点，通过Venny分析筛选出脓毒症与血管通透性可能有交互作用的疾病靶点，再将活性成分作用靶点与疾病靶点取交集，得到活性成分与疾病的交集靶点；运用Cytoscape 3.7.1软件绘制活性成分-交集靶点-疾病网络图；利用STRING数据库构建交集靶点的蛋白质与蛋白质相互作用（PPI）网络并筛选核心靶点；采用DAVID数据库对交集靶点进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路的富集分析以及可视化分析。实验验证牡丹皮对LPS诱导的血管内皮细胞通透性的改善作用及其机制：利用LPS刺激HUVECs细胞建立血管通透性模型；同时将牡丹皮制备成牡丹皮乙醇提取物冻干粉，使用DMSO配制成128 mg/mL的药物溶液。将模型细胞分为对照组、12.5μg/mL牡丹皮醇提物组（A组）、25μg/mL牡丹皮醇提物组（B组）、50μg/mL牡丹皮醇提物组（C组）、100μg/mL牡丹皮醇提物组（D组）、200μg/mL牡丹皮醇提物组（E组）共6组，采用CCK-8法测定6组细胞活力。再将细胞分为空白组、模型组（1μg/mL LPS）、地塞米松组（0.5 mmol/L地塞米松）及牡丹皮醇提物低、中、高剂量组（12.5、25、50μg/mL），采用Transwell实验考察不同浓度的牡丹皮醇提物对单层HUVECs细胞通透性的影响，并通过Western blot检测细胞间紧密连接蛋白Claudin-5（密蛋白5）、Occludin（闭合蛋白）、ZO-1（紧密黏连蛋白1）及ERK1/2和mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路相关蛋白表达量的表达情况。结果 网络药理学筛选得到牡丹皮活性成分共11个，活性成分靶点共636个，疾病靶点共815个，交集靶点90个。GO功能富集分析结果显示：交集靶点共涉及565个生物过程（BP）,62个细胞成分（CC）,90个分子功能（MF），其中BP主要包括凋亡过程负向调控、对脂多糖的反应、对缺氧的反应等；CC主要涉及细胞表面、细胞外空间、细胞外区域等；MF主要涉及相同的蛋白质结合、酶结合位点、内肽酶活力等。KEGG通路富集分析结果共富集到90条信号通路，包括癌症通路、代谢通路、c型凝集素受体信号通路等。与对照组比较，A、B、C、D组细胞活力差异均无统计学意义（P>0.05）,E组细胞活力明显降低（P<0.05），说明牡丹皮醇提物在100μg/mL以下对细胞活力无显著影响，提示在该浓度范围内无细胞毒性；与空白组比较，模型组通透性升高，Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白相对表达量均降低（P<0.05）,pERK1/2、p-mTOR、HIF-1α、VEGF的蛋白相对表达量则升高（P<0.05）；而与模型组比较，牡丹皮醇提物低、中、高剂量组及地塞米松组通透性均降低（P<0.05）,Claudin-5、Occludin、ZO-1蛋白相对表达量均升高（P<0.05）,p-ERK1/2、p-mTOR、HIF-1α、VEGF的蛋白相对表达量均降低（P<0.05）。结论 牡丹皮中的活性成分增强紧密连接蛋白的表达从而发挥改善血管通透性，机制可能与ERK1/2/mTOR/HIF-1α/VEGF信号通路有关。

关键词