摘要

目的 基于STAT3信号通路探讨钩藤碱（Rhy）抑制血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌细胞肥大的作用机制。方法 从1～2日龄的新生SD大鼠乳鼠心脏组织中提取新生大鼠心肌细胞（NRCMs）。CCK-8法检测0、2、10、20、40、80μmol/L Rhy对NRCMs细胞活力的影响，结果显示40μmol/L Rhy为最佳干预浓度。Western blot检测AngⅡ不同刺激时间（0、0.5、1、2、4、6、12、24 h）对NRCMs信号转导与转录激活因子3(STAT3)和p-STAT3核蛋白和总蛋白表达量的影响。采用AutoDock Vina V1.2.x软件进行分子对接确认Rhy和STAT3的结合力。将NRCMs分为4组，(1)对照组：正常培养基培养；(2) AngⅡ组：含1μmol/L AngⅡ的培养基培养；(3) Rhy组：含40μmol/L Rhy的培养基培养；(4) AngⅡ+Rhy组：含1μmol/L AngⅡ和40μmol/L Rhy的培养基培养。将NRCMs分为5组，(1)对照组：正常培养基培养；(2) AngⅡ组：含1μmol/L AngⅡ的培养基培养；(3) AngⅡ+Rhy组：含1μmol/L AngⅡ和40μmol/L Rhy的培养基培养；(4) AngⅡ+S3I-201组：含1μmol/L AngⅡ和10μmol/L S3I-201的培养基培养；(5) AngⅡ+S3I-201+Rhy组：含1μmol/L AngⅡ、40μmol/L Rhy和10μmol/L S3I-201的培养基培养。免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)蛋白表达；qPCR检测心房利钠肽（ANP）、脑钠肽（BNP）、胶原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）、转化生长因子-β1(TGF-β1) mRNA相对表达水平；Western blot检测p-STAT3、STAT3核蛋白表达量和p-STAT3、STAT3、TGF-β1总蛋白表达量。结果 AngⅡ不同刺激时间干预NRCMs结果显示：与0 h组比较，6、12、24 h组p-STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05）,2、4、6、12 h组STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05）;4、6、12、24 h组p-STAT3总蛋白相对表达均量明显升高（P<0.05）。分子对接结果显示：STAT3和Rhy的最佳构象结合能为-7.3 kcal/mol。该构象含有精氨酸518、丝氨酸521、谷氨酸524共3个氢键结合位点，其中丝氨酸521结合的氢键长度为2.2?，属于强氢键范围（2.2～2.5?），可能显著降低复合物的解离速率。4组分组结果：与对照组比较，AngⅡ组免疫荧光面积明显增大（P<0.05）,ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1mRNA相对表达水平均明显升高（P<0.05）,p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05）,pSTAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05）;Rhy组免疫荧光面积，ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1mRNA相对表达水平，p-STAT3、STAT3核蛋白相对表达量和p-STAT3、STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。与AngⅡ组比较，AngⅡ+Rhy组免疫荧光面积明显减小（P<0.05）,ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显降低（P<0.05）,p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05）,p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05）。5组分组结果：与对照组比较，AngⅡ组免疫荧光面积明显增大（P<0.05）,ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显升高（P<0.05）,p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05）,p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05）；与AngⅡ组比较，AngⅡ+Rhy组、AngⅡ+S3I-201组、AngⅡ+S3I-201+Rhy组免疫荧光面积均明显减小（P<0.05）,ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1 mRNA相对表达水平均明显降低（P<0.05）,p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05）,p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05）；与AngⅡ+S3I-201组比较，AngⅡ+S3I-201+Rhy组免疫荧光面积，ANP、BNP、CollagenⅠ、TGF-β1mRNA相对表达水平，p-STAT3和STAT3核蛋白相对表达量和p-STAT3和TGF-β1总蛋白相对表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。结论 Rhy可通过抑制STAT3信号通路阻止AngⅡ诱导的NRCMs细胞肥大。

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