摘要

背景神经重症医学科(NICU)患者常存在意识及肢体运动障碍,多存在侵入性操作,免疫功能降低,因此其是肺炎克雷伯菌(KP)高危感染人群。探索非多重耐药KP的致病毒力、传播特点对指导临床治疗、减少多重耐药菌转化至关重要。目的通过全基因组测序分析,了解NICU感染患者非多重耐药KP毒力基因分布与传播特征。方法收集2015—2018年开滦总医院收治的93例NICU感染患者的非多重耐药KP 94株,所有KP应用K-B法进行抗菌药物敏感试验及脉冲场凝胶电泳法(PFGE)进行同源性分析,选出其中无同源性的KP 3株,其中2015年、2016年、2017年各1株,分别编号为P20、P39、P66;2018年,选出与P66为同一流行克隆系的KP 2株,分别编号为P90、P91,且P90与P91为同一克隆株。将5株非多重耐药KP进行二代、三代全基因组测序,将所得的基因组测序结果上传至NCBI的prokaryotic annotation pipeline系统进行基因组预测基因注释,并应用BLAST软件进行对比分析,获取病原菌毒力因子数据库(VFDB)比对基因注释结果。结果将NICU感染患者5株非多重耐药KP的基因组测序结果与VFDB进行比对,结果显示,5株非多重耐药KP中共筛选出6大类52种毒力基因,包括黏附类17种(32.7%)、分泌系统类15种(28.8%)、铁吸收类15种(28.8%)、调节类3种(5.8%)、内毒素类1种(1.9%)、侵入类1种(1.9%);其中P20携带毒力基因19种(36.5%)、P39携带毒力基因18种(34.6%)、P66携带毒力基因2种(3.8%)、P90携带毒力基因47种(90.4%)、P91携带毒力基因49种(94.2%)。NICU感染患者非多重耐药KP的基因注释结果显示:(1)黏附类毒力基因:P90、P91 中均检出 fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI、ecpB、ecpE、ecpR、mrkA、mrkB、mrkD、mrkF、yagZ/ecpA、fliY 基因各1个,P20、P39 中仅检出1个fliY 基因,P66未检出此类毒力基因。(2)铁吸收类毒力基因:在同一克隆株P90、P91中均检出fepB、fepC、fepD、fepG、entA、entB、entS、iroE、ybtA、ybtX、sitB、sitC基因各1个,P90还检出1个ybtT基因,其同一流行克隆系P66检出iucB、iroC基因各1个,P20、P39均未检出此类毒力基因。(3)分泌系统类毒力基因:P20、P39、P90、P91中均检出ECS88-3547、pulB、pulD、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS 基因各1个,P20、P90、P91 均检出 1个EC55989-3327基因,P20、P39、P91均检出pulC、pulG基因,P91检出1个EC55989-3335基因,P66未检出此类毒力基因。(4)调节类毒力基因:P20、P39、P90、P91中均检出fur、PMI0229基因各1个,P90、P91还各检出1个phoP基因,P66未检出此类毒力基因。(5)在P20、P39、P90、P91中均检出1个内毒素类毒力基因(kdsA基因)和1个侵入类毒力基因(Z1307基因)。NICU患者5株非多重耐药KP全基因组中,黏附类毒力基因表达的毒力因子包括Ⅰ型菌毛(fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI)、Ⅲ型菌毛(mrkA、mrkB、mrkD、mrkF)、大肠杆菌菌毛ECP (ecpB、ecpE、ecpR、yagZ/ecpA)、腹膜鞭毛A Ⅰ 139(fliY);铁吸收类毒力基因表达的毒力因子包括肠杆菌素(entA、entB、entS、fepB、fepC、fepD、fepG)、耶尔西菌素(ybtA、ybtT、ybtX)、气杆菌素(iucB)、沙门菌素(iroC、iroE)、铁/锰酶转运(sitB、sitC);分泌系统类毒力基因表达的毒力因子包括Ⅱ型分泌系统(T2SS) (pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS)和Ⅵ型分泌系统(T6SS) (EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547);调节类毒力基因表达的毒力因子包括Fur(fur)、PhoPQ(phoP)、ABC转运蛋白通透酶(PMI0029);内毒素类毒力基因表达的毒力因子为LOS(kdsA);侵入类毒力基因表达的毒力因子为OmpA(Z1307)。结论 NICU感染患者非多重耐药KP中携带着大量的致病毒力基因,主要为黏附类、铁吸收类、分泌系统类毒力基因,还有少量的调节类、内毒素类、侵入类毒力基因。黏附类和铁吸收类毒力基因以克隆方式进行传播,这也是以克隆传代的KP株具有产生更强致病毒力的遗传学基础。

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